リアルタイムPCR法は、定量PCRのひとつであり、PCRの増幅量をリアルタイムでモニターし解析する方法。
これにより、鋳型となるDNAの定量を行うことが出来る。
この定量は、“インターカレーション法” や “ハイブリダイゼーション法”、“LUXプライマー法” といった蛍光色素を用いた方法で行われる。
・インターカレーション法
→ SYBR Greenなどの蛍光物質が伸長反応の終わったPCR産物の２本鎖DNAに入り込み発光する。
この発光を検出する。
注意点として、PCR産物が目的遺伝子以外の反応産物を合成してしまう場合には、目的とするRNAの定量が出来ないため、他の手法を用いる必要がある。
・ハイブリダイゼーション法
→ ハイブリダイゼーション法には、① TaqManプローブ法と、② FRETプローブ法がある。
① TaqManプローブ法
目的mRNAに特異的なオリゴヌクレオチドの５’末端が「蛍光物質」、３’末端が蛍光を消光させる物質である「クエンチャー」で修飾された “TaqManプローブ” を用いた手法である。
このプローブを反応系に加えると、アニーリング過程でTaqManプローブが目的とするPCR産物にハイブリダイズするが、この時点では、クエンチャーの働きによって蛍光は発しない。
伸長反応で、Taq DNAポリメラーゼによる５’→３’エキソヌクレアーゼ活性によって、ハイブリダイズしているTaqManプローブが分解され、クエンチャーが外れることで蛍光を発する。
この蛍光を検出する手法。
② FRETプローブ法
目的mRNAに特異的な２本のオリゴヌクレオチドのうち、一方の３’末端に「蛍光物質X」、もう一方の５’末端に「蛍光物質Y」が修飾されている “FRETプローブ” を用いる手法である。
この2本のオリゴヌクレオチドが、PCR産物に同時にハイブリダイズすると「蛍光物質X」の蛍光で「蛍光物質Y」が励起されることで強い蛍光を発する。
この蛍光を検出する手法。
・LUXプライマー法
→ “蛍光（LUX）プライマー” と “未標識のプライマー” の２本を用いる手法である。
LUXプライマーがヘアピン構造を取っている間は蛍光を発しないが、プライマーが２本鎖PCR産物に取り込まれると蛍光を発する。
この蛍光を検出する手法。